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Ein zu untersuchendes Blattstück von Begonien wird in einem Extraktionsbeutel unter Zugabe eines Probenpuffers zerkleinert (homogenisiert).
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Wenn eine mehr oder weniger gleichmäßig grüne Lösung vorliegt, ist die Extraktion beendet. Als Kontrolle wird ein Blatt verwendet, das sicher mit dem PFBV infiziert ist.
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Die Extrakte werden dann einzeln in ein Reagenzglas filtriert und dürfen nicht miteinander verwechselt werden.
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Die Filtrate werden in die Vertiefungen der Mikrotitergefäße gegeben, die mit Antikörpern gegen das PFBV beschichtet sind (immobilisierte Antikörper).
Nach einer 10minütigen Inkubationszeit werden nicht gebundene Viruspartikel ausgewaschen.
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Im nächsten Schritt erfolgt die Zugabe von rot gefärbtem Konjugat, das aus einem enzymgebundenen Antikörper (das Enzym ist Meerrettich-Peroxidase, POD) besteht, der sich an ein anderes Epitop des PFBV bindet.
Hier werden auch die Reaktionsgefäße 1 und 4 befüllt, in denen sich die Positivkontrolle (oben links) bzw. die Negativkontrolle (unten links) befindet.
Nicht gebundenes Konjugat wird anschließend ausgewaschen.
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Beim Sandwich-ELISA liegt das Antigen (hier ein Protein des PFBV) zwischen zwei Antikörpern, dem an der Festphase (Reaktionsgefäß) immobilisierten Antikörper I und dem enzymmarkierten Antikörper II in der Konjugatlösung. Das Enzym POD katalysiert die Umsetzung eines farblosen Substrates (A) zu einem farbigen Produkt (B)
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Anschließend wird das Substrat, farbloses 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin, zugegeben.
Durch die Enzymreaktion mit POD wird in den Fällen, wo sich der enzymgebundene Antikörper an das Antigen angelagert hat, aus dem farblosen Substrat (A) das blaugefärbte Tetramethylbenzidin-Radikal (B) gebildet, welches die Anwesenheit von PFBV anzeigt.
Im vorliegenden Fall sind drei Proben positiv.
oben links Positivkontrolleunten links Negativkontrolleblaue Färbung positive Probenkeine Färbung negative Probe
Wer sind wir...
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