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Unterricht
Gentechnik mit "Gi-Genes"
Im dritten Halbjahr des Biotechnologiekurses arbeiten die Kursteilnehmer mit Bakterien, in die mit Hilfe verschiedener Standardtechniken sogenannte Plasmid-DNA eingebaut wurde. Den erfolgreichen Einbau können die Jungforscher an der unterschiedlichen Färbung der jeweiligen Bakterienklone erkennen.
Das Konzept, das hier umgesetzt wurde, ist eine durch Prof.Dr. Manfred Kröger vom Institut für Mikro- und Molekularbiologie der Justus-von-Liebig Universität in Gießen konzipierte Weiterentwicklung des klassischen "Blue-Genes"-Experimentes" und essentieller Bestandteil des Biotechnologieprojektes der Stiftsschule St.Johann. Die Arbeitsschritte sind im Folgenden dokumentiert:
1. Anlegen einer Übernachtkultur von E.coli-Bakterien
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Eine Bakteriensuspension des Stammes E.coli XL1-blue (ohne Plasmid), der keine Amp-Resistenzgene aufweist, wird 18-24h in sterilem LB-Medium bei 37°C inkubiert (ÜN-Kultur). Aus der Suspension in der log-Phase wird am Versuchstag eine Probe erneut 3-4 h bei 37°C inkubiert ("Frischkultur").
2. Schneiden der Plasmid-DNA mit EcoRI (Restriktion)
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Eine geringe Menge Plasmid-DNA (modifizierte puC19-Plasmide mit inseriertem lacZ- bzw. gfp-Fragment, die gegenläufig sind) wird mit dem Restriktionsenzym EcoRI und entsprechendem Puffer bei 37°C inkubiert - für EcoRI existieren zwei Schnittstellen (213 bp und 4113 bp) auf dem Plasmid è 2 Fragmente (siehe Abb.unten).
3. Denaturierung des Resktrikionsenzyms und Religation des Plasmids
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Nach Hitzedenaturierung des EcoRI findet mit Hilfe von T4-Ligase eine Religation statt, wobei aus den Restriktionsfragmenten u.a. das Ursprungsplasmid (z.B. pKW3), das Plasmid mit um 180° gedrehtem Insert (pKW5) und das Plasmid ohne Insert (pKW6) gebildet werden. Die Wahrscheinlichkeit für die Bildung von pKW3 und pKW5 beträgt 1:1.
4. Kompetenzprotokoll
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Die Bakterien der Frischkultur werden durch chemische Behandlung mit Ca2+-Ionen trans- formationskompetent gemacht - die Abstände der Membranlipide vergrößern sich durch Austausch von Mg2+ gegen größere Ca2+-Ionen (hypothetisch!).
5.Transformation des E.coli-Bakterien mit den religierten Plasmiden
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Die Transformation der religierten pKW-Plasmide in die kompetenten XL1-Zellen erfolgt nach einem "Temperaturschock-Schema". Dabei werden neben den religierten Plasmiden, zur Kontrolle u.a. der Transformationskompetenz auch die ungeschnittenen Ausgangsplasmide pKW3 bzw. pKW5 verwendet.
6. Ausstrich, Induktion und Selektion
Die transformierten Bakterien werden auf vorbereitete Selektionsnährböden mit dem Antibiotikum Ampicillin, dem Induktor IPTG und dem Substrat X-Gal (einem Indolyl-Galactosid) ausplattiert. Dadurch werden die Gene angeschaltet und in Produkte umgesetzt (exprimiert).
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a) Die XL1-Bakterien haben den Stress des Kompetenzprotokolls überstanden und wachsen auf einem amp-freien LB-Agar als Bakterienrasen. Auf amp-haltigem LB-Agar findet (wegen des fehlenden ampR-Gens) kein Wachstum statt.
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b) Nach erfolgreicher Transformation wird durch den Induktor IPTG der lac-Repressor inaktiviert, das nach dem Promotor folgende lacZ wird exprimiert, die ß-Galactosidase spaltet das X-Gal in Galactose und Indolyl, das an der Luft dimerisiert und einen blauen Indigofarbstoff bildet ("Blue Genes")
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c) Nach Restriktion und Religation von pKW5 sind im Tageslicht wieder blaue pKW5-Klone, aber auch weiße Klone zu sehen.
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d) Ein Teil der weißen Klone fluoresziert im UV-Licht durch die Anwesenheit des Green-Fluorescent-Protein (GFP) grün, weil durch den um 180° gedrehten Einbau des Fragmentes nun das gfp-Gen und nicht das lacZ-Gen exprimiert wird. Die im UV-Licht nicht leuchtenden weißen Klone enthalten das religierte Plasmid ohne Insert (pKW6), d.h. sie besitzen lediglich die amp-Resistenz.
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Beispielhafte Zusammenschau der Versuchsergebnisse einer Arbeitsgruppe, die pKW5 als Ausgangsplasmid benutzt hatte.
7. Die Klone unter dem Mikroskop
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8. Restriktionskarte der Plasmide
Das Schema zeigt die verwendeten Plasmide und die Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme (man spricht von einer Restriktionskarte).
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