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ELISA-Test

Immunologischer Nachweis des PFBV in Pelargonien

Etwa jede vierte Geranie ist mit dem Geranien-Blütenbruch-Virus (engl. Pelargonium flower break virus, PFBV) infiziert. Äußerlich ist die Infektion manchmal an Veränderungen der Blütenfarbe zu erkennen. Für den Menschen ist das PFBV völlig ungefährlich, da es ausschließlich Pflanzen infiziert. Mit Hilfe eines Sandwich-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) wird das Pelargonium Flower Break Virus mit Hilfe enzymmarkierter Antikörper in den Blättern nachgewiesen.
Auf ähnliche Art und Weise lassen sich Virusproteine oder Antikörper gegen Viren im Blut nachweisen.


 

Ein zu untersuchendes Blattstück von Begonien wird in einem Extraktionsbeutel unter Zugabe eines Probenpuffers zerkleinert (homogenisiert).

 

Wenn eine mehr oder weniger gleichmäßig grüne Lösung vorliegt, ist die Extraktion beendet. Als Kontrolle wird ein Blatt verwendet, das sicher mit dem PFBV infiziert ist.

 

Die Extrakte werden dann einzeln in ein Reagenzglas filtriert und dürfen nicht miteinander verwechselt werden. 

 

Die Filtrate werden in die Vertiefungen der Mikrotitergefäße gegeben, die mit Antikörpern gegen das PFBV beschichtet sind (immobilisierte Antikörper).

Nach einer 10minütigen Inkubationszeit werden nicht gebundene Viruspartikel ausgewaschen.

 

Im nächsten Schritt erfolgt die Zugabe von rot gefärbtem Konjugat, das aus einem enzymgebundenen Antikörper (das Enzym ist Meerrettich-Peroxidase, POD) besteht, der sich an ein anderes Epitop des PFBV bindet.
Hier werden auch die Reaktionsgefäße 1 und 4 befüllt, in denen sich die Positivkontrolle (oben links) bzw. die Negativkontrolle (unten links) befindet.
Nicht gebundenes Konjugat wird anschließend ausgewaschen.

 

Beim Sandwich-ELISA liegt das Antigen (hier ein Protein des PFBV) zwischen zwei Antikörpern, dem an der Festphase (Reaktionsgefäß) immobilisierten Antikörper I und dem enzymmarkierten Antikörper II in der Konjugatlösung. Das Enzym POD katalysiert die Umsetzung eines farblosen Substrates (A) zu einem farbigen Produkt (B) 

 

Anschließend wird das Substrat, farbloses 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin, zugegeben.
Durch die Enzymreaktion mit POD wird in den Fällen, wo sich der enzymgebundene Antikörper an das Antigen angelagert hat, aus dem farblosen Substrat (A) das blaugefärbte Tetramethylbenzidin-Radikal (B) gebildet, welches die Anwesenheit von PFBV anzeigt.
Im vorliegenden Fall sind drei Proben positiv.
oben links Positivkontrolleunten links Negativkontrolleblaue Färbung positive Probenkeine Färbung negative Probe

 

Johanneshaus & Mensa

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